어류의 골격은 다양한 연구에 활용되는데요 오늘은 이 어류의 골격을 염색하는 방법에 대하여 알아보겠습니다.
요즘은 인터넷에서 간단하게 키트를 살 수 있지만 조금 더 정확하고 전문적인 방법을 소개하고자 합니다.
이 글은 Taylor W.R., Van Dyke G.C.가 1985년 작성한 Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study를 정리한 것입니다.
준비시약
1. 10% 중성 포르말린 용액
완충 중성 포르말린 10% 용액을 준비한다.. 이 경우 중성 포르말린 용액 1L당 인산일나트륨(Na2H2PO4H2O) 4g과 인산이나트륨(Na2H2PO4H2O) 6.5g를 증류수 약간에 녹여 용액에 넣는다. 중성포르말린이 아닌 경우 탄산칼슘을 고정시에 약간 첨가한다.
2. 알카인 블루 염색약
에틸알코올(99%)와 빙초산(100% 아세트산)을 6:4로 섞어 준비한다. 95% 에틸알코올과 빙초산을 8:2로 섞는 방법도 있지만 불안정하고 염색이 연하게 된다. 이 용액 100mL당 알카인 블루 8GX(또는 8GN)을 9~30mg 정도 섞는다. 미리 만들어둔 용액은 상온에서 3~4주 정도 보관할 수 있다.
3. 수산화칼륨 용액
1~1.5%의 수산화칼륨 수용액을 증류수로 준비한다.
4. 붕산나트륨 포화용액
붕산나트륨 십수화물(Na2B4O7 H2O)을 증류수에 맑아질 때 까지 녹인 다음 상층액을 덜어 준비한다
5. 효소 완충 용액
4번 상층액과 증류수를 3:7로 섞어서 준비한다.
6. 글리세린 용액
글리세린과 수산화 칼륨 수용액 또는 증류수를 각각 4:6, 또는 7:3 비율로 섞어 준비한다.
방법
1. 고정
용기의 3/4 정도를 10% 포르말린 용액으로 채운다. 무완충의 경우 탄산칼슘 가루를 넣어 포화용액으로 만들어준다. 중성 완충 포르말린의 경우 이 과정이 필요 없다. 생물을 용액에 담가 죽인 후 첫날에는 몇 시간마다 용기를 부드럽게 돌려주고 2~3일 째에는 포르말린을 조금 씩(리터당 약 50ml 또는 그 이상) 교체해준다. 크기에 따라 3~5일 또는 그 이상 포르말린에 고정한다.
생물이 클 경우 복강을 절개하고 단단한 피부나 외피는 제거해야하지만 불필요하게 뼈나 연골에 손상을 주지 않도록 한다.
2. 염색 준비
자어단계 어류는 즉시 알리자린 레드로 염색할 수 있다. 이중 염색을 하기 위해서는 50, 70, 90% 에틸알코올에 약 12~24시간 담근 후 순수 에틸알코올에 보관해둔다. 고정 이후에는 물로 세척할 수는 있으나 물에 잠겨서는 안 되며 알코올에 담근 이후에는 절대 물에 담그거나 세척해서는 안된다.
3. 제유
만약 지방질이 많거나 유분이 많은 표본의 경우 에틸알코올과 크실렌(Xylene)에 담가 제유(除油) 한다. 이 과정은 필요한 경우에만 실시한다.
4. 알카인 블루 염색
표본을 크실렌 또는 에틸알코올에서 즉시 알카인 블루 염색 용액으로 옮겨 약 12~24시간(3~5cm 기준) 정도 염색한다. 염색시간은 최대한 짧게 하며 염색 표본의 크기나 실제 염색된 정도를 보고 조절한다. 만약 에틸 알코올이 95% 이하라면 사용할 수 없다.
5. 중화
염색 이후 표본을 다량의 포화붕산용액 또는 수산화칼륨용액에 담근 후 하루에서 이틀간 둔다. 표본이 우락부락하거나 큰 경우(10cm 이상) 첫 날 용액을 갈아준다.
6. 탈색
표본을 H2O2 3퍼센트 수용액과 수산화칼륨 수용액을 각각 2:8 또는 1:9로 섞은 용액에 넣어 몸 내부까지 전부 탈색되도록 둔다. 보통 1시간에서 몇 시간 정도 걸리며 몸 내부까지 용액이 닿을 수 있도록 복강을 열어주어도 좋다. 색소를 완전히 탈색시킬 필요는 없지만 살이 전부 창백해지는 정도까지는 진행해야하며 만약 용액이 산화되어 약한 기포가 생기면 용액을 새 것으로 교체해준다.
7. 투명화
표본을 부피의 10~40배 되는 효소 완충용액에 담근 후 트립신(Trypsin) 가루를 0.45g 첨가하여 잘 섞는다. 트립신 가루의 양은 표본의 크기에 따라 조절한다.
8. 알리자린 레드 염색
수산화나트륨 용액에 알리자린 레드 분말을 넣어 짙은 보라색 또는 원하는 색깔이 될 때 까지 넣어서 용액을 준비한다. 이후 표본을 넣어 골격을 염색한다.
9. 세척
표본을 증류수로 세척한다. 이후 내장을 꺼내고 비늘과 불필요한 부분을 제거한다.
10. 최종세척
표본을 증류수로 세척한다. 복강 안에 알칼리 성분이 남아 있는 경우 효소 완충용액에 담가 중화시킨다. 이후 다시 7로 돌아가 투명화한다.
11. 구아닌 제거
만약 표본에 구아닌이나 구아닌 같은 물질이 남아있다면 2~4% 수산화칼륨 수용액에 담가 제거한다. 이 과정은 필요한 경우에만 실시한다.
12. 글리세린 저장
효소로 투명화시킨 표본을 40, 70, 100% 글리세린 용액에 순차적으로 담가 저장한다. 이때 100% 글리세린에는 티몰(C10H14O)을 약간 첨가한다. 이후 유리나 플라스틱 용기에 보관한다.
위 방법은 연골과 경골을 모두 염색하는 이중 염색법으로 만약 연골만 염색할 경우 8번 그리고 추가로 2, 3, 4, 11번을 생략할 수 있다. 또 경골만 염색할 경우 4, 5번 그리고 추가로 2, 3, 11번을 생략할 수 있다. 각 표본의 크기마다 염색 시간이나 투명화 시간이 다르기 때문에 표본을 크기별로 분류해야하며 같은 용액에 두지 않거나 염색되는 즉시 작은 것들을 제거해야 한다.
저도 가자미로 시도해봤는데
트립신이 없어서 그런가 투명화가 안되더군요.
나중에 본격적으로 한번 올려보겠습니다.
감사합니다.
