서론

산화질소는 산화질소 합성효소에 의해서 L-아르기닌에서 L-시트룰린으로 산화될 때 만들어진다.내피 세포들은 내피 산화질소 합성효소(eNOS)를 통해 산화질소를 생성할 수 있다.이 산화질소들은 혈관의 탄력성을 유지하는데 중요한 생리적 역할을 한다.

또, 산화질소는 평활근의 생장을 조절하고 백혈구가 내피에 달라붙는 것을 늦춰주며혈소판의 응집을 억제한다. 산화질소는 사람의 심혈관계 질환의 병태생리(​어떤 질병이나 질환이 처음 발병할 때의 원인과 그 진행과정을 말한다.)에중요한 역할을 한다.

산화질소의 생산 및 활동 저하는 고혈합, 혈전증, 혈관연축, 동맥경화를 일으킬 수 있다.혈관에서 산화질소의 생산은 eNOS 유전자에 의해 조절되는 eNOS 발현정도에 연관성이 있는 것으로 생각된다.그러므로 eNOS의 다형성(같은 종의 생물이지만, 모습이나 고유한 특징이 다양한 성질)의 변동성을 조사하는 것이허혈성 심질환 및 뇌혈관 질환과 같은 많은 혈관성 질환에서의 유전적 연관성을 설명할 수 있게 해줄 수 있다.

eNOS 유전자의 다형성은 뇌졸중 환자군 집단 중 고령과 인종별로 이미 조사된 적이 있다.비록 연구들 사이의 결과가 상이하긴 하지만, eNOS 다형성이 뇌졸중과 연관이 있다는 것은 일맥상통한다.eNOS 유전자는 7q35-36 염색체에 자리해있으며, 26 엑슨(엑슨:진핵생물의 유전자 가운데 최종 단백질 산물을 만들어 내는 부분, 혹은 전사 이후에 일어나는 RNA 가공 후에도RNA의 구조적 부분으로 남아 있는 부분)으로 구성돼 있다.

eNOS 유전자의 여러 다형성중, 뇌혈관질환과 연관있는것으로 조사된건 다음 3가지이다.

the Glu298Asp polymorphism in exon 7, the variable number of tandem repeats[VNTR, 27 bp repeat] polymorphism in intron 4, and the T-786C polymorphism in the 5′-flanking region of eNOS

출산전후 저산소성 허혈성 뇌병증(Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)은 출산시 신생아에게자주 일어날 수 있는데, 심하고 오래갈 경우 신경학적 손상을 유발할 수 있다.
출산전후 HIE에서의 뇌혈류량 감소는 산화질소의 활동성과 연관이 있음이 밝혀졌다.혈관내피에서 생성되는 산화질소는 뇌혈관의 확장을 유도한다. 이것으로 뇌혈류량을 늘리게 된다.

하지만 허혈상태인 동안 산화질소로 인한 혈관 확장으로 뇌혈류량이 증가하면, 재관류 손상을 유발할 수 있다.(수술후 마취를 하게 되면 혈액의 흐름이 일시적으로 정지되는데마취에서 깨어났을 때 혈액이 다시 흐르면서 엄청난 활성산소가 생기고 이로 인해 여러 조직들이 손상받기 쉬운 상태.)(역주: 뇌경색등으로 혈관이 막혀 피가 적게가다가 혈관 개통되어 다시 많이 가는 경우 재관류 손상이 올수 있습니다.)
게다가 저산소성 허혈의 경우 과도하게 만들어진 산화질소가 슈퍼옥사이드와 반응이 일어나서 지질의 과산화반응과신경 손상을 일으킬 수 있는 활성 퍼옥시나이트라이트를 생성할 수 있다.

출산전후 HIE 환자들에게는 eNOS 다형성의 변동성이 신생아 시기 뇌에서의 eNOS 활동성 및 산화질소 생성과 연관있으며이로 인해 임상적으로 나타나는 결과가 달라질 수 있다.그러나 이전에는 eNOS과 출산전후 HIE에 관한 리포트가 없었다.

그래서 이 연구는 PCR(중합효소 연쇄 반응. DNA를 증폭하는 검사방법)을 사용하여 출산전후 HIE 환자에게 임상적으로연관이 있는 eNOS 유전자의 다형성에 대해 평가했다.
추가컨대 eNOS의 다형성과 출산전후 HIE의 합병증이 연관돼 있는지에 대해서도 같이 접근하였다.




재료 및 방법(실험 방법)

실험대상(연구군)이 연구의 연구집단은 정상 혹은 만삭아(역주:예상된 출산시기가 거의 다 되어 태어난 아이를 뜻함. 얼마전에'후기 미숙아'로 바꾸자고 했던 말이 있던 듯합니다.) 중 중증도-중증 출산전후 HIE를 겪은 37명의 환자집단(HIE군)과 54명의 출산전후에 문제가 없는 정상 출생아(대조군)로 구성했으며, 이들은 2002년과 2004년 사이단국대병원 신생아 중환자실 혹은 신생아실에 입원하였다.

출산전후 HIE 집단은 모두 출산전후 질식(가사, asphyxia)의 진단기준을 만족하였으며 출산전후 질식의 급성 뇌병증 양상을 보였다.모든 HIE 집단은 Sarnat 분류(출산전후 HIE에 대한 분류 척도.)로 따졌을 때 중증도에서 중증의 임상적 경과를 보였다.

HIE 집단의 제태연령(임신0일부터 출산 후까지의 기간)은 36주 이상이었고, 5분 아프가 점수(역주:신생아의 상태평가를하는 척도입니다.)는 7점 미만, 혈액가는 산성(pH<7.2), 저산소 및 과탄산증이었다.

신생아중 중대 선청성 질환, 자궁내 감염, 패혈증, 다태분만(다산), 과숙아는 배제됐다.모든 신생아는 한국계였고 혈연관계는 없었다.모든 신생아의 부모님들에게 인폼드 컨센트를 받았다.(역주:연구 동의 받았다는 얘기입니다.)연구는 단국대 연구회로부터 승인되었다.

DNA 추출과 제노타이핑(제노타이핑:개체가 가지는 유전형의 다양성을 분석하는 일)말초혈액이 추출됐으며, EDTA 튜브에 담겼다. 게놈의 DNA는 혈액의 백혈구에서 추출되었다.

3개의 임상적으로 연관있는 eNOS 다형성은 이전에 연구되었던 대로 결정되었다.엑슨 7의 Glu298Asp 제노타이핑은 전사 및 역전사 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭으로 하였다.(각각 5′-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3′and 5′-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3′)

증폭된 258-bp 절편은 Banll라는 제한효소를 분해하였으며, 63 bp와 85 bp 절편으로 분해된 군과(wild-type allele ‘‘G’’), 분해되지 않은군으로 나뉘었다. (variant allele ‘‘A’’)

이 절편들은 12% 아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석되었고, 실버 스테인으로 시각화됐다.5′-flanking region(유전자의 5'말단에 인접한 DNA 영역) of eNOS에서의 T-786C 다형성을 검출하기 위해,각각 PCR을 사용하였다.

증폭된 결과물들은 Mspl에 의해 분해되었으며, 140bp 40bp로 분해되는 wildtype allele과,90, 50, and 40으로 분해되는 variant (allele ‘‘C’’)로 나뉘었다.

이 절편들은 12% 아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석되었고, 실버스테인으로 시각화되었다.인트론 4의 VNTR 다형성을 관찰하기 위해 각각 5′-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3′와5′-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3′ 전사 및 역전사 프라이머를 사용하였다
이 PCR 생성물들은 2.5% 아가로오스 겔 전기영동으로 분석되었고, 브로민화 에티듐(DNA에 결합하는 색소로서 전기영동을 통해 DNA의 크기를 측정하고자 할 때 염색물질로 쓰였으나, 발암성 물질로 알려져 있다.)스테인으로 시각화되었다.

420 bp의 야생형은 5개의 27 bp repeat들로 되어있었고 (the ‘‘b’’ allele),393개 bp 변종들은 4개의 27 bp repeat들로 되어있었다 (the ‘‘a’’ allele)

eNOS 유전자 세개의 다형성의 유전자형은 피규어 1번에 있다.VNTR의 4aa와 T-786C의 CC는 이 연구에서는 어느 신생아에서도 검출되지 않았다. 




Statistical analysis (통계 분석)

이 데이터는 윈도우 14.0 버전의 SPSS 통계 패키지 프로그램으로 분석되었다.유전자형의 관찰된 빈도는 Hardy-Weinberg 평형에서 기대되는 빈도 수치와 비교되었다.유전형질, 대립유전자, 하플로타입의 빈도의 차이는Student’s t-test, or Fisher’s exact test로 검정되었다.p밸류는 0.05 미만이 의미있는 것으로 생각하였다.승산비(두 집단의 이항변수에 관한 승산(odds)의 비를 가리킨다.)와 95퍼센트 신뢰구간은 제시된 바대로 따랐다.

,,,의학 공부 1도 안해본 고딩이 2주만에 저걸 이해하고 영작가능하다고?

누구 말대로 논문은 대학원생이 다해주고 조국딸은 지시하는대로 실험만 했거나, 아님 전부 대학원생이 하고 이름만 올린거 같은데.